干貨分享 | 細胞凍存及復蘇避坑指南！
細胞培養是生命科學實驗中離不開的實驗之***，它有廣泛的應用。細胞培養可以用于研究細胞的信號轉導、合成代謝、生長增殖等。細胞培養的常見實驗包括細胞復蘇、細胞傳代和細胞凍存等，其中細胞凍存及復蘇的過程對于細胞生長狀態有重要影響。
局部電解質濃度改變，pH值改變，部分蛋白質變性；
細胞內冰晶形成，可引起溶酶體的損傷使溶解酶釋放，造成細胞內結構成分的破壞、線粒體腫脹、功能喪失并造成細胞能量代謝障礙；
細胞膜上的類脂蛋白復合體在冷凍中易發生破壞引起膜通透性改變，使細胞內容物喪失；
細胞核在冷凍保存時也易受損。
為了降低在細胞凍存時對細胞的損傷，可以在凍存時加入凍存保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）（SKU：02196055）以降低對細胞損傷或死亡。DMSO作為滲透性細胞保護劑，其能夠迅速穿透細胞膜進入細胞中，防止細胞內液冰晶的形成，以及防止細胞結構紊亂等。
二甲基亞砜（DMSO）結構式
研究表明，不同濃度的DMSO對細胞活力均有影響，DMSO濃度不超過10%時，對細胞的活力影響較小（如圖1）。除此之外，DMSO濃度為10%時，抑菌效果能夠接近***。在DMSO中加入適宜濃度的血清，有助于解凍后提高細胞收獲率和其功能活性的恢復。因此，細胞凍存時常常使用10%濃度的DMSO，可以在其中加入胎牛血清等作為保護劑，血清有助于解凍后細胞功能活性的恢復（如圖2為細胞凍存流程圖）。
圖1. DMSO濃度與細胞活力[1]
圖2. 細胞凍存操作流程圖
細胞復蘇是指將凍存在液氮或低溫冰箱中的細胞解凍后重新培養，使其恢復生長的過程。細胞復蘇過程中，需要遵循快速融化的原則，這樣可以保證細胞外結晶短時間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內再形成冰晶對細胞造成損傷。細胞復蘇后1-2天，細胞活性會逐漸得到恢復（如圖3為復蘇HEK293T細胞數對數值）。 細胞復蘇的主要實驗過程如下： 步驟1：從液氮容器或低溫冰箱中取出凍存管，迅速將其浸入37℃的溫水中，并不時搖動以使其盡快融化。37℃水浴時間盡可能短（1-2min），因為延長時間會增加細胞死亡率； 步驟2：當細胞完全融化后，從水浴中取出凍存管，用酒精棉球消毒外部，然后開啟瓶蓋； 步驟3：將細胞懸液轉移到離心管中，加入適量的培養液，并進行離心，以去除DMSO和死細胞； 步驟4：離心后，棄去上清液，用新的培養液重懸細胞，并計數，調整細胞密度； 步驟5：將細胞接種到培養瓶中， 37℃靜置培養。在培養初期，應注意觀察細胞狀態，以確保其正常生長。 圖3. HEK-293T細胞生長曲線（復蘇后）[2] 圖4. 細胞復蘇操作流程圖
細胞凍存及復蘇是細胞培養常見的實驗方法，選擇合適的方法以及合理的操作能夠保證細胞的活性。除此之外，選擇合適的凍存保護劑也是該實驗中較為關鍵的***步，例如DMSO應當選擇內毒素水平低、細胞培養***的產品，能夠降低對細胞的損傷。a
(文章來源于儀器網)
